骨仿生學(xué)和結(jié)構(gòu)工程激發(fā)了人們對優(yōu)化人工支架以實現(xiàn)更好的骨再生的廣泛興趣。然而，支架孔隙形態(tài)調(diào)節(jié)骨再生背后的機制尚不清楚，這使得用于骨修復(fù)的支架結(jié)構(gòu)設(shè)計具有挑戰(zhàn)性。為了解決這個問題，來自華南理工大學(xué)的況宇迪、趙娜如、王迎軍等人仔細(xì)評估了三種代表性孔隙形態(tài)（即圓柱形（C）、螺旋形（G）和菱形（D））β-TCP支架的成骨性能（圖1a）。結(jié)果表明 D 型支架通過增強 RhoA/ROCK2 通路的機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn) BM

SC 向成骨分化并分泌更多與遷移相關(guān)的生長因子，從而在這些支架中實現(xiàn)最佳骨再生（圖1b）。這項工作為開發(fā)新型生物適應(yīng)性支架設(shè)計提供了對孔隙形態(tài)介導(dǎo)的骨再生機制的見解。相關(guān)研究成果以“3D printed pore morphology mediates bone marrow stem cell behaviors via RhoA/ROCK2 signaling pathway for accelerating bone regeneration"為題于2023年3月20日發(fā)表在《Bioact. Mater.》上。

圖1 不同孔隙形態(tài)的支架方案及支架-BMSC相互作用機制：（A）具有圓柱形、螺旋形和菱形孔形態(tài)的 3D 打印支架；（B）孔隙形態(tài)介導(dǎo)的細(xì)胞骨架力和 BMSCs 的核變形通過 RhoA/ROCK2 信號通路促進(jìn)骨再生

1. 不同孔形態(tài)的β-TCP支架上的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為

成功制備了三種孔結(jié)構(gòu)的β-TCP支架（圖2a），BMSCs在支架上表現(xiàn)出不同的鋪展?fàn)顟B(tài)(圖2b)。由于細(xì)胞的不同伸展和伸長狀態(tài)會影響基因的表達(dá)，這些支架上的BMSCs可能會表現(xiàn)出不同的細(xì)胞行為和命運。隨后制備了一種定制的具有整合路徑的支架（每個路徑由一種孔形態(tài)組成）評估BMSCs從支架外到支架內(nèi)部的遷移行為，如圖2C所示。遷移實驗表明，D-和G-支架具有更好的引導(dǎo)骨再生的潛力（圖2D，E）。CCK8檢測結(jié)果顯示，BMSCs在C-支架上的增殖情況明顯好于其他各組(圖2F)，這可能歸因于類多邊形展開態(tài)引起的內(nèi)應(yīng)力的松弛堿性磷酸酶（ALP）活性（圖2G）和RT-qPCR（圖2H）結(jié)果顯示，第7天，D支架組ALP、Col-1、OCN和Runx2的表達(dá)最高，C支架組最。低。上述結(jié)果證實了D-支架在這些支架中誘導(dǎo)BMSCs成骨分化效。果。最。好。此外，研究了孔形態(tài)對BMSCs血管生成因子旁分泌的影響（圖2I）)。成血管測試表明G-支架組BMSC培養(yǎng)上清液中VEGF和Ang-1的濃度最高（圖2J），具有更好的骨再生效果（圖2K,L）。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同β-tCP支架上的細(xì)胞行為

2. 孔形態(tài)介導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

RNA測序結(jié)果顯示，與C組相比，D組和G組的一些基因表達(dá)上調(diào)（圖3A），表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在D-支架中的遷移能力最。強。此外，與C-支架組相比，G-和D-支架組中成骨分化相關(guān)基因(例如OCN3、BMP2和ALPK1)和血管生成相關(guān)因子(例如VEGFA、PDGFC和PDGFA)也上調(diào)(圖3B，C)。聚類分析和熱圖的樹狀圖顯示，RhoA/ROCK2信號通路相關(guān)基因(DVL2、DAAM1、RhoA和ROCK2)在G-和D-支架組的表達(dá)高于C-支架組(圖3D)。RT-qPCR分析和Western blotting也證實了RhoA/ROCK2信號通路相關(guān)基因和蛋白在G-支架和D-支架中的高表達(dá)(圖3E-L)。這些結(jié)果揭示了BMSCs在不同孔形態(tài)的支架中進(jìn)行不同的細(xì)胞骨架重組和機械應(yīng)力傳遞。

圖3 RNA測序和生物信息學(xué)分析

隨后，檢測了在不同支架上培養(yǎng)的BMSCs在含有和不含RhoA/ROCK2抑制劑的培養(yǎng)液中的成骨分化和遷移因子水平。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中沒有RhoA/ROCK2抑制劑時，G-和D-支架組比C-支架組RhoA、ROCK2和激活蛋白(p-RhoA、p-ROCK2)水平更高(圖4A-D)。CDC42、OCN和Runx2的蛋白表達(dá)水平順序為D-支架>G-支架>C-支架。這些結(jié)果表明，RhoA/ROCK2信號通路在轉(zhuǎn)導(dǎo)支架孔形態(tài)刺激調(diào)控BMSCs成骨分化和遷移中發(fā)揮了重要作用。圖4E是支架孔形態(tài)介導(dǎo)的BMSC行為機理圖，孔形態(tài)通過RhoA/ROCK2信號通路影響B(tài)MSCs成骨分化和遷移。

圖4 (A-C)藥物對RhoA/ROCK2信號通路的干預(yù)；(D)用ELISA法檢測在RhoA和RoCK2抑制劑干預(yù)前后7天不同孔隙形態(tài)的成骨相關(guān)Runx2和遷移相關(guān)CDC42蛋白的水平；(E)機制綜述：孔形態(tài)通過RhoA/ROCK2信號通路影響B(tài)MSCs成骨分化和遷移

3. 不同孔形態(tài)支架體內(nèi)骨再生的評價

隨后，構(gòu)建股骨髁缺損評價支架體內(nèi)骨再生效果（圖5A）。骨小梁計數(shù)、Micro-CT、血管分布檢測、Van Gieson染色(VG)結(jié)果均顯示G-和D-支架的血管生成能力強于C-支架，可以促進(jìn)骨再生。

圖5 股骨髁缺損區(qū)術(shù)后4周、8周、12周植入支架的組織學(xué)分析及Micro-CT檢查

此外，通過連續(xù)熒光標(biāo)記檢測所有支架在2-4周和6-8周的動態(tài)成骨來評估骨再生率(圖6)。柱狀缺損區(qū)被分為三個部分(外層：0-1 mm，中層：1-2 mm，內(nèi)層：2-3 mm)，以更好地定量缺損區(qū)不同區(qū)域的新骨生長(圖6a)。熒光標(biāo)記染色結(jié)果顯示，C-支架組支架的新骨沉積速度從外到中逐漸減慢，C-支架中心區(qū)域幾乎沒有新骨(圖6B，C)。相比之下，D和G支架的中層和中心層的骨沉積速率明顯較高，表明細(xì)胞在支架中的遷移速率不同。這些結(jié)果揭示了支架形態(tài)對體內(nèi)新骨生長的重要指導(dǎo)作用。

圖6 成骨的動態(tài)組織學(xué)分析

綜上所述，本文在體外和體內(nèi)評估了三種孔結(jié)構(gòu)的β-TcP支架的成骨潛力。D-支架通過影響B(tài)MSCs的黏附狀態(tài)，激活較高水平的RhoA/ROCK2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞遷移，促進(jìn)BMSCs的成骨分化。同時，D-支架和G-支架還可通過影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌來促進(jìn)血管生成。在體內(nèi)骨修復(fù)的評價中，D-支架在促進(jìn)骨修復(fù)方面的表現(xiàn)優(yōu)于G-支架和C-支架。這項工作加深了我們對孔形態(tài)影響細(xì)胞行為的機制的理解。